“修饰”的必要性
生产mRNA疫苗过程中的酶促反应会生成一些双链RNA，产生应激反应，最终导致翻译抑制和mRNA降解。对制备的mRNA进行纯化，减少双链副产物，减少免疫反应。单链RNA本身也是一种PAMP，能够引起I型干扰素产生。
目前已有多种修饰技术被用于产生更稳定的mRNA。1）用人工合成的非天然核糖核酸替换天然核糖核酸来合成mRNA；2）加上5’帽子、3’poly(A)“尾巴“和UTR（untranslatedregion）序列；3）利用特殊的新型制剂技术，有效地保护mRNA。
图丨mRNA修饰途径方法（来源：Cell）
具体作用效果如下：
1）合成“帽子”类似结构和“加帽酶（cappingenzymes）”来稳定mRNA，通过与真核翻译起始因子4E（eukaryotictranslationinitiationfactor4，EIF4E）的结合来增强蛋白质的翻译；
2）在5’和3’UTR区域增加可调控序列，稳定mRNA；
3）修饰Poly（A）“尾巴”，稳定mRNA，增强蛋白质翻译；
4）修饰核苷酸，减少先天免疫激活；
5）分离和（或）纯化技术：利用RNaseIII处理和快速蛋白液相色谱（fastproteinliquidchromatography，FPLC）纯化，降低免疫激活并提高翻译率；
6）优化序列和密码子，选择与tRNA同源的密码子，提高翻译率；
7）靶细胞的调节：翻译起始因子和其他方法的共同递送，优化翻译和免疫原性。
大厂利器：假尿嘧啶修饰
化学修饰是调节生物大分子功能特异性的方法，并涉及多种疾病的治疗（包括癌症等）。现有研究表明，在RNA中已显示存在着多种不同类型的合成后修饰，RNA的4种碱基以及核糖都可以成为修饰的靶标。换句话说，此种方式用人工合成的非天然核糖核酸替换天然核糖核酸来合成mRNA，从而大大降低其固有的免疫原性和不稳定性。
其中，在真核生物mRNA上发现的修饰总共有16种，其中有13种修饰已被RNA修饰数据库（RNAModificationDatabase，RNAMDB）收录，这些修饰可以分为甲基化、假尿嘧啶化和次黄嘌呤三类。对哺乳动物内部的mRNA修饰主要围绕N1-和N6-甲基腺苷（m1A，m6A），3-和5-甲基胞嘧啶（m3C，m5C），5-羟甲基胞嘧啶（hm5C），假尿苷(Ψ)和2-O-甲基化（Nm）等。
在mRNA疫苗研发过程中，主要的修饰方法是N6-甲基腺苷、假尿苷(Ψ)和2-O-甲基化（Nm）。N6-甲基腺苷（m6A）起到调节mRNA稳定性的作用。而人体对mRNA疫苗的免疫反应主要和尿苷(部分由尿嘧啶组成)有关，利用假尿嘧啶替代尿嘧啶就能够减少免疫系统对mRNA的识别，RNA5帽子的2-O-甲基化修饰可以使其逃脱宿主的抗病毒应答。
mRNA疫苗“大厂”Moderna和BioNTech都是利用假尿嘧啶修饰保持mRNA的稳定性。
假尿嘧啶修饰是最丰富的RNA修饰，一般由尿苷的异构化产生，已有的研究表明，mRNA的假尿嘧啶化修饰主要有三个功能：改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。mRNA假尿嘧啶化修饰的过程是由假尿嘧啶合成酶（pseudouridinesynthases，PUS）进行催化，让尿嘧啶核苷酸（U）化学结构发生改变，形成假尿嘧啶核苷核苷酸。之前研究已在tRNA、rRNA、snRNA中发现了大量的假尿嘧啶，最近的研究证实假尿嘧啶同样存在于mRNA中。
年，Karijolich等发现，mRNA上的假尿嘧啶化修饰可以改变密码子。将酵母中的密码子中的尿嘧啶(U)替换为假尿嘧啶，这些密码子就能编码氨基酸，年，Schwartz等发现，酵母发生热休克时，会由Pus7p（一种蛋白）额外引入超过个假尿嘧啶修饰位点，如果敲除PUS7基因，则那些含有新引入修饰的mRNA会减少，这说明着假尿嘧啶修饰可能会增强转录本稳定性。
Moderna在成立之初，其创始人之一DerrickRossi将RNA中的尿嘧啶、胞嘧啶替换为假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶，修饰后的RNA更像是细胞内源性物质，从而克服天然免疫应答（现已经发展到第六代）。这种RNA修饰方法并不是Rossi首创，发明人是宾夕法尼亚大学的KatalinKarikó和DrewWeissman，关于这项修饰技术归属权问题，也一直是Moderna的受争议的原因之一。
图丨Moderna官方并没有给出太多技术平台的细节（图片来源：Moderna
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